La pérdida de KDM5B mejora la fibrosis y la disfunción cardíacas patológicas al mejorar epigenéticamente la expresión de ATF3

Medicina experimental y molecular volumen 54, páginas 2175–2187 (2022)Citar este artículo

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La fibrosis cardíaca excesiva es fundamental para la remodelación cardíaca adversa y la disfunción que conduce a la insuficiencia cardíaca en muchas enfermedades cardíacas. La metilación de histonas juega un papel crucial en varios eventos fisiopatológicos. Sin embargo, el papel de las enzimas de modificación de la metilación de histonas en la fibrosis cardíaca patológica debe dilucidarse por completo. Aquí, identificamos la lisina desmetilasa 5B (KDM5B), una histona H3K4me2/me3 desmetilasa, como un mediador epigenético clave de la fibrosis cardíaca patológica. La expresión de KDM5B aumentó en fibroblastos cardíacos y tejidos miocárdicos en respuesta al estrés patológico. La deficiencia de KDM5B mejoró notablemente la fibrosis cardíaca, mejoró la función cardíaca y evitó la remodelación cardíaca adversa después de un infarto de miocardio (MI) o sobrecarga de presión. El tratamiento con KDM5B knockout o inhibidor restringió la transición de los fibroblastos cardíacos a miofibroblastos profibrogénicos y suprimió las respuestas fibróticas. La deficiencia de KDM5B también facilitó la transformación de los fibroblastos cardíacos en células de tipo endotelial y promovió la angiogénesis en respuesta a la lesión miocárdica. Mecánicamente, KDM5B se unió al promotor de la activación del factor de transcripción 3 (Atf3), un regulador antifibrótico de la fibrosis cardíaca, e inhibió la expresión de ATF3 al desmetilar la modificación H3K4me2/3 activada, lo que condujo a una mayor activación de la señalización de TGF-β y una expresión excesiva de genes profibróticos. Nuestro estudio indica que KDM5B impulsa la fibrosis cardíaca patológica y representa un objetivo candidato para la intervención en la disfunción cardíaca y la insuficiencia cardíaca.

Las cardiopatías isquémicas e hipertróficas, que son las dos enfermedades cardiovasculares más prominentes que conducen a la insuficiencia cardíaca, comparten el sello patológico común del remodelado cardíaco adverso. La fibrosis cardíaca es la manifestación característica central de la remodelación cardíaca adversa inducida por lesiones cardíacas, que puede ser provocada por isquemia, sobrecarga hemodinámica, activación neurohumoral y citocinas1. La fibrosis cardíaca se caracteriza típicamente por la sobreactivación y la proliferación excesiva de miofibroblastos, lo que altera el equilibrio entre la síntesis y la degradación de las proteínas de la matriz extracelular2. Si bien la fibrosis apropiada es beneficiosa para mantener la estructura cardíaca para prevenir la ruptura cardíaca en algunas afecciones, como el infarto de miocardio (IM), la respuesta fibrótica sobreactivada provoca un depósito excesivo de fibras de colágeno en el miocardio localizado o en todo el miocardio para alterar la arquitectura miocárdica y disminuir la distensibilidad miocárdica. resultando en el desarrollo de disfunción cardíaca, arritmias e insuficiencia cardíaca3,4. Una gran cantidad de literatura demuestra que la fibrosis cardíaca patológica representa una vía principal que media los resultados clínicos en la insuficiencia cardíaca para pacientes que están expuestos a eventos de estrés cardíaco isquémico y no isquémico5. Sin embargo, un enfoque terapéutico efectivo para la fibrosis cardíaca es muy limitado, lo que nos insta a explorar más a fondo los mecanismos clave que subyacen a la fibrosis cardíaca patológica.

Entre los múltiples tipos de células del corazón, los fibroblastos residentes en el corazón se consideran las fuentes más predominantes de miofibroblastos, y representan aproximadamente el 11 % del total de células en el corazón de un ratón adulto6,7. En condiciones fisiológicas normales, los fibroblastos se encuentran en estado de reposo. Sin embargo, en el corazón lesionado, los fibroblastos se transdiferencian en miofibroblastos activados y contribuyen significativamente a la remodelación cardíaca en respuesta a múltiples tensiones patológicas8. Además de mediar en la fibrosis cardíaca, los fibroblastos también pueden remodelar el corazón dañado en determinadas circunstancias. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que los fibroblastos pueden adoptar un fenotipo endotelial y promover la angiogénesis para reparar el corazón lesionado9,10. Por lo tanto, la regulación precisa del destino de los fibroblastos en condiciones de estrés es vital para mejorar la función cardíaca y prevenir la fibrosis cardíaca patológica. Sin embargo, los mecanismos que controlan el destino de los fibroblastos y mantienen su estado de activación apropiado siguen sin entenderse por completo.

Múltiples mecanismos reguladores están involucrados en la modulación de la fibrosis cardíaca11. Los mecanismos epigenéticos, incluida la metilación de histonas, juegan un papel esencial en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica12. Se ha demostrado que diferentes estímulos patológicos pueden inducir alteraciones en los perfiles de metilación de histonas de varios tipos de células cardíacas13. Estas alteraciones pueden contribuir al desequilibrio en la homeostasis en múltiples tipos de células en el corazón, incluido el aumento de la expresión de genes asociados con la fibrosis en los fibroblastos13. Un estudio anterior mostró que la histona lisina metiltransferasa DOT1L (disruptor del silenciamiento telomérico similar a 1) contribuyó a la respuesta profibrótica en los fibroblastos cardíacos al mejorar la activación de la señalización del factor de crecimiento transformante β (TGF-β)/SMAD14, lo que sugiere que manipular la metilación de histonas El perfil tiene un gran potencial para superar la fibrosis cardíaca patológica. Sin embargo, es necesario explorar más a fondo si otras enzimas de modificación de la metilación de histonas desempeñan un papel clave en el control del destino celular y las respuestas profibróticas en los fibroblastos cardíacos.

La desmetilasa 5B específica de lisina (KDM5B), que también se conoce como PLU1 o Jumonji AT-rich interactive domain 1B (JARID1B), media la desmetilación de la trimetilación activada por transcripción y la dimetilación de H3 en la lisina 4 (H3K4me3 y H3K4me2), suprimiendo la expresión de genes diana15. Algunos estudios han demostrado que la expresión anormal de KDM5B se asocia con el desarrollo de múltiples trastornos, incluida la promoción de la tumorigénesis y enfermedades inflamatorias16,17. Sin embargo, aún se desconoce el papel de KDM5B en las enfermedades cardiovasculares. Aquí, encontramos que la pérdida de KDM5B bloqueó significativamente la activación de los fibroblastos cardíacos y promovió la angiogénesis al aumentar el nivel de metilación de H3K4me2/3 y promover la expresión del factor de transcripción activador 3 (ATF3) en los fibroblastos cardíacos, que reprimió la fibrosis cardíaca patológica y previene la disfunción cardíaca. Nuestro estudio aclaró el papel regulador epigenético crítico de KDM5B en la patogenia de la fibrosis cardíaca aberrante.

La proteína TGF-β de ratón recombinante (7666-MB) se adquirió de R&D Systems (Minneapolis, MN). La angiotensina II (AngII) (CSN10313) se adquirió de CSNpharm (Chicago, IL). Los anticuerpos contra la actina de músculo liso α (α-SMA) (ab5694, para análisis de inmunotransferencia), fosfo-SMAD3 (miembro 3 de la familia SMAD) (ab52093) y KDM5B (ab181089, para análisis de inmunofluorescencia) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). ). Los anticuerpos contra el colágeno tipo I (AB765p) se obtuvieron de Millipore (Billerica, MA). Los anticuerpos contra α-SMA (5228, para inmunofluorescencia e inmunohistoquímica) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Darmstadt, Alemania). Los anticuerpos contra el colágeno tipo III (NB600-594) se obtuvieron de Novus Biologicals (Littleton, CO). Anticuerpos contra fosfo-SMAD2 (miembro de la familia SMAD 2) (3108), SMAD2 (5339), SMAD3 (9523), fosfo-ERK (MAP quinasa regulada por señal extracelular) (9106), ERK (4696), fosfo-JNK (c -Jun N-terminal quinasa) (4668), JNK (9252), fosfo-p38 (4511), p38 (9212), fosfo-p65 (3033 S), p65 (8242), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (5174) y ATF3 (18665) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Los anticuerpos contra KDM5B (A301-813A, para análisis de inmunotransferencia) se obtuvieron de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX).

Se obtuvieron ratones C57BL/6 de tipo salvaje de Sipper BK Laboratory Animals (Shanghai, China). Se generaron ratones KDM5B-knockout (KO) utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Las 428 bases que contenían el dominio JmjC, que es responsable de su actividad desmetilasa, se eliminaron del gen Kdm5b, lo que provocó un cambio de marco en el gen Kdm5b y la pérdida de función de KDM5B. Todos los ratones se mantuvieron bajo condiciones de barrera de nivel libre de patógenos específicos en el Centro de animales experimentales de la Universidad de Tongji, y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Para la sobrecarga de presión inducida por AngII, se implantó subcutáneamente en los ratones una minibomba osmótica (Alzet Model 2004; Alza Corp) que contenía una infusión de solución salina o AngII (1000 ng/kg/min) durante 28 días. Para el modelo MI, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda se realizó como se describió previamente18. Brevemente, después de la anestesia por inhalación de isoflurano (2,5 l/min de isoflurano a 1,5 l/min de O2), se ventilaron ratones macho de 8 a 10 semanas de edad con un ventilador para animales pequeños a un volumen tidal de 0,45 ml para respiración asistida. La cavidad torácica se abrió a través de una toracotomía izquierda para exponer el corazón y la rama descendente anterior izquierda se ligó permanentemente con una ligadura de seda 8-0. El tórax y la piel se cerraron con ligaduras 5-0 y 4-0, respectivamente. Después de retirar el tubo traqueal, los ratones se colocaron en una almohadilla térmica a 37 °C hasta que recuperaron la conciencia total. Al final del programa experimental después de la infusión de AngII o la cirugía MI, todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de la anestesia con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg de peso corporal), seguido de la disección del tejido cardíaco y las investigaciones experimentales pertinentes. . Se utilizó ecocardiografía bidimensional (Vevo 2100; VisualSonics) con una sonda de modo M y frecuencia de 30 MHz para medir la función cardíaca de los ratones anestesiados en puntos de tiempo preprogramados de manera ciega.

Se aislaron fibroblastos cardíacos primarios del miocardio ventricular izquierdo de ratones. Brevemente, los corazones disecados de ratones de 2 semanas de edad se picaron en pequeños trozos de aproximadamente 1 mm3 con tijeras y luego se incubaron con un tampón de digestión precalentado que contenía 0,125 % de tripsina a 37 °C durante 10 min. Los sobrenadantes se recogieron después de mezclarlos repetidamente con una pipeta y los tejidos restantes se procesaron 4 o 5 veces hasta que se completó la digestión. Las fracciones de fibroblastos cardíacos se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en DMEM con suero bovino fetal al 10% (Gibco, MA). Las células resuspendidas se sembraron en placas de cultivo de tejidos tratados (Corning, NY) en una incubadora humidificada. Para el silenciamiento de Kdm5b se utilizaron dos siRNA específicos de Kdm5b prediseñados o siRNA de control dirigidos a diferentes secuencias de diferentes compañías (Dharmacon, CO; Santa Cruz Biotechnology, TX). Los fibroblastos cardíacos adherentes se transfectaron con ARNip de Kdm5b o ARNip de control utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El ARN total se extrajo de tejidos miocárdicos o fibroblastos cardíacos cultivados con reactivo TRIzol (Invitrogen, CA) y se transcribió inversamente con un kit de síntesis de ADNc First Strand (TOYOBO, Shanghái, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cDNA de cada muestra se utilizó para evaluar los cambios en la expresión de diferentes genes utilizando QuantStudio 6 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Los datos se normalizaron a la expresión de Gapdh.

El análisis de micromatrices se realizó con matrices Agilent Whole Mouse Genome 4 × 44 K. El ARN total se extrajo de las muestras utilizando TAKARA RNAiso (TAKARA, Dalian, China) de acuerdo con los procedimientos operativos estándar del fabricante. Se verificó la calidad del ARN total mediante electroforesis Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA) y se purificó usando un mini kit RNeasy (QIAGEN, Dusseldorf, Alemania) y un conjunto de DNasa libre de RNasa (QIAGEN). El etiquetado, la hibridación y el lavado se realizaron de acuerdo con las directrices de Agilent. Las micromatrices hibridadas completas se escanearon utilizando un escáner de micromatrices Agilent (Agilent Technologies, CA). Las señales de micromatrices y la información de fondo se recuperaron con el software Feature Extraction 10.7 (Agilent Technologies) y se normalizaron con el software GeneSpring 12.6.1 (Agilent Technologies). Los puntos de corte para la expresión diferencial se establecieron como un cambio de pliegue absoluto >2 y un valor de p corregido <0,05. Los datos de micromatrices del transcriptoma están disponibles en Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE197223.

Se aislaron fibroblastos cardíacos del miocardio ventricular izquierdo de ratones WT KDM5B-knockout o compañeros de camada el día 7 después del IM. Las muestras de ARN se aislaron de fibroblastos cardíacos para la construcción de bibliotecas y se secuenciaron con Illumina NovaSeq 6000 para generar lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Las lecturas se asignaron al genoma del ratón de referencia (mm10) utilizando HISAT2 con parámetros predeterminados. Los valores de fragmento por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM) se utilizaron para evaluar la expresión génica diferencial. La agrupación de genes expresados diferencialmente, el análisis de enriquecimiento funcional de Gene Ontology (GO) y otros análisis de datos se realizaron utilizando programas personalizados. Los datos de secuenciación de ARN están disponibles en Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE213746.

Se recubrieron placas de cuarenta y ocho pocillos con matriz de Matrigel Corning reducida en factor de crecimiento (Corning Life Sciences, MA) y se polimerizaron durante 30 min a 37 °C según el protocolo del fabricante. Se tripsinizaron cantidades iguales de fibroblastos cardíacos cultivados aislados de ratones KDM5B-KO y compañeros de camada WT y se sembraron en las placas recubiertas. Después de 4 a 6 h de incubación, se fotografió la formación de tubos mediada por fibroblastos cardíacos.

Las proteínas totales se extrajeron de tejidos miocárdicos o fibroblastos cardíacos cultivados con tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Merck, Darmstadt, Alemania) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Las concentraciones de las proteínas extraídas se midieron con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Se usaron cantidades iguales de proteínas para realizar el análisis de inmunotransferencia.

Se prepararon corazones aislados para el análisis histológico usando el método de corte en parafina como se describió previamente19. Brevemente, los corazones cosechados se fijaron en paraformaldehído al 4% y luego se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en una serie de secciones de 5 μm de espesor. Se realizó la tinción tricrómica de Masson para evaluar el área de la cicatriz fibrótica usando un kit de tinción tricrómica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tinción inmunofluorescente e inmunohistoquímica se realizó como se describió previamente10. Las imágenes digitales se capturaron utilizando un sistema de microscopio Leica (Wetzlar, Alemania).

Los fibroblastos cardíacos se entrecruzaron usando formaldehído al 1% (vol/vol) y la reacción se terminó con glicina 0,125 M. Luego, los complejos proteína‒ADN en las células entrecruzadas recolectadas se sometieron a ultrasonidos en agua helada para formar fragmentos aleatorios de entre 200 pb y 500 pb de tamaño. Los extractos sobrenadantes se recolectaron por centrifugación y luego se sometieron a análisis ChIP de acuerdo con el protocolo del Chromatin Immunoprecipitation Kit (Millipore). Las secuencias del promotor del gen diana en el ADN de entrada y los inmunocomplejos de ADN recuperados se detectaron mediante Q-PCR. Los datos se normalizaron con el control de entrada de ADN correspondiente. Los cebadores utilizados para detectar el promotor del gen Atf3 de ratón fueron los siguientes: 5'-TGACAGGGGGCCATTTGAG AAATC-3' (directo) y 5'-CCTCTGAGCAACTCCACAGAGCA-3' (inverso).

La significación estadística de las diferencias entre dos grupos se determinó mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Para las comparaciones de más de dos grupos, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías con la prueba t de la diferencia menos significativa. Los datos se analizaron con Prism 7 (GraphPad) y los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Para examinar las enzimas de modificación de la metilación de histonas que modulan la progresión de la fibrosis cardíaca después de una lesión miocárdica, primero medimos los cambios en su expresión en los tejidos miocárdicos después de un infarto de miocardio o una sobrecarga de presión. Entre estas enzimas de modificación de la metilación de histonas, el aumento en la expresión del ARNm de Kdm5b fue el más significativo en el miocardio isquémico de ratones después de un IM (Fig. 1a). La expresión de KDM5B en el miocardio aumentó de manera dependiente del tiempo, alcanzando su punto máximo el día 7 después del IM (Fig. 1b, c). Además, observamos cambios en la expresión de KDM5B en respuesta a la sobrecarga de presión y descubrimos que la expresión de Kdm5b estaba marcadamente elevada en el miocardio después de la sobrecarga de presión inducida por la infusión de AngII (Fig. 1d). Luego determinamos el tipo celular que contribuyó al aumento de la expresión de KDM5B en el miocardio después del estrés patológico. El análisis de inmunofluorescencia mostró que el aumento en la expresión de KDM5B se distribuyó predominantemente en fibroblastos cardíacos positivos para α-SMA, pero no en cardiomiocitos en tejidos miocárdicos sometidos a infusión de MI o AngII (Fig. 1e, f y Fig. 1a-d complementaria). Además, el tratamiento con TGF-β aumentó los niveles de expresión de ARNm y proteína de KDM5B en fibroblastos cardíacos primarios aislados del miocardio de ratón (Figura complementaria 1e, f). Estos resultados sugieren que la histona desmetilasa KDM5B, que se encuentra aumentada en los fibroblastos cardíacos, está involucrada en procesos patológicos en respuesta a diferentes tipos de lesión miocárdica.

un análisis de Q-PCR de los niveles de expresión de ARNm de las enzimas de modificación de la metilación en tejidos miocárdicos de ratones WT el día 7 después del IM o la operación simulada (n = 3 para el grupo simulado, n = 4 para el grupo MI). b, c Análisis de Q-PCR del ARNm de Kdm5b (n = 6 ratones por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína KDM5B en tejidos miocárdicos de ratones WT el día indicado después del IM o la operación simulada. # indica los números de serie de los ratones. d Análisis Q-PCR de la expresión del ARNm de Kdm5b en tejidos miocárdicos de ratones WT el día 28 después de la infusión de AngII o solución salina normal (NS) (n = 6 ratones por grupo). e Tinción de inmunofluorescencia representativa de KDM5B (rojo) o α-SMA (verde) en tejidos miocárdicos de ratones WT el día 7 después de un IM o una operación simulada. Barra de escala, 50 μm (ampliada: 10 μm). f Tinción de inmunofluorescencia representativa de KDM5B (rojo) o α-SMA (verde) en tejidos miocárdicos de ratones WT el día 28 después de la infusión de AngII o NS. Barra de escala, 50 μm (ampliada: 10 μm). *p < 0,05, ***p < 0,001. Se realizó la prueba t de Student no pareada (a, d) o ANOVA unidireccional (b).

Se generaron ratones deficientes en KDM5B en un fondo C57BL/6 con el sistema CRISPR/Cas9, que medió una eliminación de 428 pb en el dominio Jmjc que es responsable de su actividad desmetilasa y la mutación de cambio de marco que lo acompaña en el gen Kdm5b (Figura complementaria 2a ). Casi no hubo expresión de ARNm o proteína de KDM5B en fibroblastos cardíacos de ratones KDM5B-KO (Figura complementaria 2b, c). Además, la tinción inmunofluorescente no mostró expresión de KDM5B en los núcleos de fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B (Fig. 2d complementaria). El análisis de ecocardiografía no indicó diferencias en la función cardíaca entre KDM5B-KO y los ratones WT compañeros de camada de control en condiciones fisiológicas (Fig. 2e, f complementarias). La tinción tricrómica de Masson sugirió que los ratones deficientes en KDM5B no mostraron ninguna remodelación cardíaca adversa en comparación con los ratones WT en condiciones fisiológicas (Fig. 2g complementaria). A continuación, exploramos el papel de KDM5B en la función cardíaca y la remodelación después de un IM. Los ratones KDM5B-KO mostraron mayores porcentajes de fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) y acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) en comparación con los ratones WT compañeros de camada de control en los días 14 a 28 después del IM (Fig. 2a). También se observaron dimensiones ventriculares izquierdas reducidas y volúmenes ventriculares izquierdos en ratones KDM5B-KO después de un IM (Fig. 2a y Fig. 3a complementaria), lo que indica que la deficiencia de KDM5B mejoró la función contráctil y redujo la dilatación del ventrículo izquierdo del corazón después de un IM. La deficiencia de KDM5B disminuyó las relaciones entre el peso del corazón y el peso corporal (HW/BW) y entre el peso del corazón y la longitud de la tibia (HW/TL) (Fig. 3b, c complementarias). La tinción con tricrómico de Masson y rojo Sirius reveló una marcada disminución de las áreas de cicatriz y fibrosis en el miocardio de los ratones KDM5B-KO en comparación con los ratones WT después de un IM (Fig. 2b-e). Los niveles de expresión de ARNm de genes relacionados con la fibrosis, incluida la cadena alfa 1 de colágeno tipo I (Col1a1), la cadena alfa 1 de colágeno tipo III (Col3a1), la fibronectina 1 (Fn1), el factor 2 de la red de comunicación celular (Ccn2), Tgfb y actina El músculo liso alfa 2 (Acta2) en el miocardio se suprimió drásticamente por la deficiencia de KDM5B (Fig. 2f y Fig. 3d complementaria). La inmunofluorescencia y la tinción inmunohistoquímica indicaron un número limitado de miofibroblastos positivos para α-SMA en el miocardio y una expresión reducida de colágeno III en los miofibroblastos de ratones KDM5B-KO (Fig. 2g y Fig. 3e complementaria, f). Estos datos indican que KDM5B exacerba la fibrosis cardíaca mediada por miofibroblastos sobreactivados, lo que provoca una peor disfunción cardíaca y una remodelación cardíaca adversa después de un infarto de miocardio.

a Medición ecocardiográfica de la FEVI, la LVFS, la dimensión interna diastólica final del ventrículo izquierdo (LVIDd) y la dimensión interna sistólica final del ventrículo izquierdo (LVID) de ratones KDM5B-KO o WT al inicio (Día 0) y el día indicado después MI o operación simulada (n = 6 ratones por grupo). b–e Imágenes de tinción tricrómica representativa de Masson y cuantificación del tamaño de la cicatriz (b, c) o imágenes de tinción con rojo Sirius y cuantificación del área de fibrosis (d, e) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después del IM . n = 6 ratones por grupo. Barra de escala, 1,6 mm (superior), 200 μm (inferior). f Análisis de Q-PCR de los niveles de ARNm de Col1a1 y Col3a1 en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 14 después del IM o la operación simulada (n = 6 ratones por grupo). g Tinción de inmunofluorescencia representativa de α-SMA (rojo) y Col III (verde) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 14 después del IM (n = 6 ratones por grupo). Barra de escala, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Se realizó la prueba t de Student no pareada (c, e) o ANOVA (a, f).

Investigamos más a fondo el papel de KDM5B en la función cardíaca y la fibrosis después de la sobrecarga de presión. La deficiencia de KDM5B mejoró significativamente la función cardíaca después de la sobrecarga de presión inducida por la infusión de AngII (Fig. 3a-c). Los ratones deficientes en KDM5B mostraron una disminución del peso del corazón con respecto al peso corporal y las proporciones de longitud de la tibia (Fig. 3d, e). La tinción tricrómica de Masson mostró que la fibrosis miocárdica perivascular e intersticial se atenuó drásticamente en ratones con deficiencia de KDM5B en comparación con ratones WT sometidos a infusión de AngII (Fig. 3f-i). Los niveles de ARNm de los genes relacionados con la fibrosis, incluidos Acta2, Col1a1, Col3a1 y el factor de crecimiento del tejido conjuntivo (Ctgf), disminuyeron notablemente en los tejidos miocárdicos de ratones con deficiencia de KDM5B después de la infusión de AngII (Fig. 3j). La deficiencia de KDM5B inhibió la expresión de proteínas de colágeno I y colágeno III en tejidos miocárdicos después de la infusión de AngII (Fig. 3k). La tinción de inmunofluorescencia mostró una producción reducida de colágeno III en los miofibroblastos positivos para α-SMA limitados en el miocardio de ratones con deficiencia de KDM5B después de la infusión de AngII (Fig. 3l y Fig. 3g complementaria). Estos resultados demuestran que la deficiencia de KDM5B protege contra la disfunción cardíaca, la fibrosis cardíaca y la remodelación patológica provocada por la sobrecarga de presión.

a Imágenes ecocardiográficas representativas en modo M de ventrículos izquierdos de ratones KDM5B-KO o WT de control de compañeros de camada el día 28 después de la infusión de AngII o solución salina normal (NS). b, c Medición ecocardiográfica de la FEVI (b) y la FEVI (c) de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de la infusión de AngII o NS (n = 6 ratones por grupo). d, e La relación entre el peso del corazón y el peso corporal (HW/BW) (d) y la relación entre el peso del corazón y la longitud de la tibia (HW/TL) (e) de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de AngII o NS infusión (n = 6 ratones por grupo). f–i Imágenes tricrómicas representativas de Masson y cuantificación de fibrosis perivascular (f, g) o intersticial (h, i) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de la infusión de AngII o NS (n = 6 ratones por grupo) . Barra de escala, 200 μm (izquierda), 100 μm (derecha). j Análisis Q-PCR de los niveles de expresión de ARNm de Acta2, Col1a1, Col3a1 y Ctgf en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de la infusión de AngII o NS (n = 6 ratones por grupo). k Análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína Col I y Col III en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de la infusión de AngII o NS. l Tinción de inmunofluorescencia representativa de α-SMA (rojo) y Col III (verde) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 28 después de la infusión de AngII. Barra de escala, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01. Se realizó la prueba t de Student no pareada (g, i) o ANOVA unidireccional (b-e, j).

Luego investigamos el efecto de KDM5B en las respuestas fibróticas en fibroblastos. Se realizó un análisis de RNA-seq para identificar las características del perfil transcriptómico de los fibroblastos cardíacos primarios aislados de los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO y WT después de un IM. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) sugirió que los ratones KDM5B-KO mostraron una expresión disminuida de genes relacionados con la organización de las fibrillas de colágeno y la organización de la matriz extracelular, que son dos características distintivas predominantes de la remodelación cardíaca adversa y la fibrosis cardíaca (Fig. 4a-d complementaria). Los fibroblastos cardíacos primarios aislados de los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO y WT se trataron con el factor profibrótico TGF-β in vitro. Los niveles de expresión de ARNm de genes relacionados con la fibrosis, incluidos Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2, disminuyeron notablemente en fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B en respuesta a TGF-β (Fig. 4a). Consistentemente, se observaron niveles de expresión de proteína suprimida de colágeno I y colágeno III en fibroblastos cardíacos deficientes en KDM5B después de la estimulación con TGF-β (Fig. 4b). Se observaron disminuciones similares en los niveles de expresión de estas moléculas relacionadas con la fibrosis en fibroblastos cardíacos con eliminación de Kdm5b mediada por dos tipos de siRNA específicos en respuesta a TGF-β (Fig. 4c, d y Fig. 5a-c complementaria). GSK467 se identificó como un inhibidor potente y selectivo de KDM5B20. Después del tratamiento con GSK467, los niveles de ARNm de Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 y los niveles de proteína de colágeno I y colágeno III inducidos por TGF-β en fibroblastos cardíacos se inhibieron significativamente (Fig. 4e, f). La transformación de fibroblastos a miofibroblastos con fenotipo profibrótico se caracteriza por una mayor expresión de α-SMA y cambios morfológicos en la formación de numerosos haces de microfilamentos de actina21. La tinción inmunofluorescente mostró una producción marcadamente restringida de α-SMA y una morfología de fibroblastos conservada en fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B y fibroblastos de tipo salvaje con eliminación de Kdm5b o tratamiento con GSK467 después de la estimulación con TGF-β (Fig. 4g-i y Fig. 5d complementaria). Estos resultados indican que KDM5B facilita la formación de fenotipos de miofibroblastos y la progresión de la fibrosis mediada por fibroblastos cardíacos.

a, b Análisis Q-PCR de la expresión de ARNm de Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 (a) (n = 6 por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas Col I y Col III (b) en compañeros de camada o con deficiencia de KDM5B (KO) control de fibroblastos cardíacos WT estimulados con TGF-β (10 ng/ml) durante 24 h. c, d Análisis Q-PCR de la expresión del ARNm de Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 (c) (n = 6 por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína Col I y Col III (d) en siRNA silenciado con Kdm5b o control transfectado fibroblastos cardíacos estimulados con TGF-β (10 ng/ml) durante 24 h. e, f Análisis Q-PCR de la expresión de ARNm de Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 (e) (n = 6 por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas Col I y Col III (f) en fibroblastos cardíacos tratados con el inhibidor de KDM5B GSK467 o DMSO seguido de estimulación con TGF-β (10 ng/ml) durante 24 h. g-i Tinción de inmunofluorescencia representativa de α-SMA (rojo) en fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B (g), eliminación de KDM5B (h) o tratamiento con GSK467 (i) y los fibroblastos cardíacos de control correspondientes (g-i) estimulados con TGF- β (10 ng/ml) durante 24 h. Se obtuvieron resultados similares de tres experimentos independientes (g-i). Barra de escala, 50 μm. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Se realizó la prueba t de Student para datos no apareados (a, c, e).

La activación de la vía de señalización de TGF-β dependiente de SMAD o independiente de SMAD es un determinante esencial de la fibrosis. La supresión de la fosforilación de SMAD2 y SMAD3 indicó una disminución en la activación de la señalización de TGF-β dependiente de SMAD en los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO después de un IM (Fig. 5a). La activación de la señalización de TGF-β independiente de SMAD, incluida la fosforilación de ERK, JNK, p38 y p65, se vio afectada en los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO después de un IM (Fig. 5b). Consistentemente, se observó la activación suprimida de la señalización de TGF-β dependiente de SMAD o independiente de SMAD, como lo indica la disminución de la fosforilación de SMAD2, SMAD3, ERK, JNK, p38 y p65, en los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO después de la infusión de AngII ( Figura 5c, d). Además, la deficiencia o caída de KDM5B suprimió notablemente la activación de SMAD2, SMAD3, ERK, JNK, p38 y p65 inducida por TGF-β en fibroblastos cardíacos primarios (Fig. 5e-f y Fig. 6a, b complementaria). Estos datos indican que KDM5B facilita las respuestas fibróticas y la transición de los fibroblastos cardíacos al mejorar la activación de la señalización de TGF-β dependiente de SMAD o independiente de SMAD en condiciones patológicas.

a Análisis de inmunotransferencia de niveles fosforilados (p-) o totales de proteínas SMAD2 y SMAD3 en los lisados de tejidos miocárdicos de KDM5B-KO o ratones WT de control de compañeros de camada después de MI o operación simulada. b Análisis de inmunotransferencia de los niveles fosforilados o totales de las proteínas ERK, JNK, p38 y p65 en los lisados de tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT después de un IM o una operación simulada. c Análisis de inmunotransferencia de los niveles fosforilados o totales de las proteínas SMAD2 y SMAD3 en los lisados de tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT después de la infusión de AngII o solución salina normal (NS). d Análisis de inmunotransferencia de niveles fosforilados o totales de proteínas ERK, JNK, p38 y p65 en los lisados de tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT después de la infusión de AngII o solución salina normal (NS). e Análisis de inmunotransferencia de los niveles fosforilados o totales de las proteínas SMAD2 y SMAD3 en los lisados de fibroblastos cardíacos de ratones KDM5B-KO o WT tratados con TGF-β (10 ng/ml) durante los tiempos indicados. f Análisis de inmunotransferencia de los niveles fosforilados o totales de las proteínas ERK, JNK, p38 y p65 en los lisados de fibroblastos cardíacos de ratones KDM5B-KO o WT tratados con TGF-β (10 ng/ml) durante los tiempos indicados. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes.

Estudios previos han demostrado que la angiogénesis mejora la disfunción cardíaca y la remodelación cardíaca adversa después de un IM y una sobrecarga de presión inducida por AngII22,23. El análisis de micromatrices de ARN de los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO y ratones WT compañeros de camada de control después de MI indicó los genes expresados diferencialmente enriquecidos vinculados a la angiogénesis (Fig. 7a complementaria). Además, se observó una mayor expresión de genes asociados a la angiogénesis regulados positivamente y una expresión disminuida de genes asociados a la angiogénesis regulados negativamente en los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO después de un IM (Fig. 7b complementaria). La deficiencia de KDM5B mejoró los niveles de expresión de los genes marcadores endoteliales, incluidos el factor de crecimiento endotelial vascular A (Vegfa), Cd31, el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (Vegfr2), la óxido nítrico sintasa 3 (Nos3) y el factor de von Willebrand (Vwf), en el miocardio. tejidos después de MI (Fig. 6a). Se ha informado que la angiogénesis mediada por la transición de fibroblastos a células endoteliales facilita la reparación cardíaca después de una lesión miocárdica9. De acuerdo con el análisis de micromatrices, un análisis adicional de secuencias de ARN de fibroblastos aislados de los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO y WT mostró el enriquecimiento de genes expresados diferencialmente relacionados con la angiogénesis después de un infarto de miocardio (Fig. 6b). GSEA mostró un conjunto de genes significativamente regulado al alza enriquecido en la vía de señalización VEGF proangiogénica ampliamente reconocida en fibroblastos cardíacos de ratones KDM5B-KO en comparación con ratones WT después de MI (Fig. 6c). Además, los principales genes expresados diferencialmente revelados fueron el aumento de la expresión de genes relacionados con la angiogénesis regulados positivamente y la disminución de la expresión de genes relacionados con la angiogénesis regulados negativamente en fibroblastos cardíacos de ratones KDM5B-KO después de MI (Fig. 6d). Además, se aislaron cardiomiocitos y fibroblastos cardíacos de los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO y WT el día 7 después del IM para la detección de alteraciones genéticas. Como se muestra en la Fig. 7c complementaria, la deficiencia de KDM5B no afectó la expresión génica relacionada con la angiogénesis en los cardiomiocitos, pero aumentó sus niveles de expresión en los fibroblastos cardíacos. La tinción de inmunofluorescencia mostró una mayor expresión de VEGFR o IB4 colocados con fibroblastos cardíacos positivos para vimentina en los tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO después de un IM (Fig. 6e, f y Fig. 7d, e complementaria). La deficiencia de KDM5B aumentó los niveles de expresión de genes marcadores endoteliales, incluidos Vegfa, Cd31, Vegfr2, Nos3 y Vwf, en fibroblastos cardíacos primarios aislados de tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO (Fig. 6g). La deficiencia de KDM5B mejoró la formación de tubos mediada por fibroblastos cardíacos primarios (Fig. 7f complementaria). Estos datos indican que la pérdida de KDM5B facilita la transición de fibroblastos a células de tipo endotelial y refuerza la angiogénesis, atenuando la fibrosis y disfunción cardiaca en respuesta a lesiones patológicas.

un análisis de Q-PCR de los niveles de ARNm de Vegfa, Cd31, Vegfr2, Nos3 y Vwf en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 7 después de la cirugía MI (n = 6 ratones por grupo). b Análisis de enriquecimiento de Gene Ontology que muestra los 15 principales genes expresados diferencialmente en fibroblastos cardíacos primarios aislados de los tejidos cardíacos de KDM5B-KO y ratones WT de control de compañeros de camada el día 7 después de la cirugía MI (proceso biológico BP, componente celular CC, función molecular MF). c Gráfica de enriquecimiento de GSEA que muestra conjuntos de genes asociados con la vía de señalización de VEGF en fibroblastos cardíacos primarios como en b. d Mapa de calor que muestra genes expresados diferencialmente en relación con la regulación positiva y negativa de la angiogénesis en fibroblastos cardíacos primarios como en b. e, f Tinción de inmunofluorescencia representativa de VEGFR (verde) (e), IB4 (verde) (f) y vimentina (roja) (e, f) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 7 después de la cirugía MI. Barra de escala, 50 μm. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. g Análisis Q-PCR de la expresión de ARNm de Vegfa, Cd31, Vegfr2, Nos3 y Vwf en fibroblastos cardíacos deficientes en KDM5B (KO) o WT estimulados con TGF-β (10 ng/ml) durante 24 h (n = 4 por grupo). *p < 0,05, **p < 0,01. Se realizó la prueba t de Student para datos no apareados (a, g).

Investigamos más a fondo el mecanismo subyacente a la fibrosis cardíaca atenuada y la disfunción mediada por la deficiencia de KDM5B. Entre los principales genes expresados sobrerregulados examinados a partir de ARN de tejidos miocárdicos en ratones KDM5B-KO y ratones WT compañeros de camada de control después de MI, el marcado aumento de la expresión de Atf3 en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO llamó nuestra atención (Fig. 7a). De manera consistente, el análisis de RNA-seq mostró una mayor expresión de Atf3 en fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B (Fig. 8a complementaria). Estudios previos han demostrado que la expresión elevada de ATF3 en fibroblastos cardíacos puede prevenir la remodelación cardíaca adversa y suprimir la fibrosis miocárdica inducida por lesión isquémica o hipertrófica24,25. La expresión de atf3 en los tejidos miocárdicos de ratones de tipo salvaje alcanzó su punto máximo el Día 1 después del IM y luego disminuyó a un nivel relativamente más alto en los Días 3-7 (Fig. 7b). La deficiencia de KDM5B aumentó la expresión de ARNm y proteínas de ATF3 en tejidos miocárdicos después de un IM (Fig. 7c, d). Los niveles de ARNm y proteína de ATF3 en fibroblastos cardíacos primarios estimulados con TGF-β aumentaron mediante la eliminación de Kdm5b o el tratamiento con inhibidor de GSK467 (Fig. 7e-h y Fig. 8b, c complementarias). Los niveles de expresión de genes relacionados con la fibrosis como Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 en fibroblastos cardíacos primarios inducidos por TGF-β disminuyeron significativamente después de la eliminación de Kdm5b o aumentaron después de la eliminación de Atf3 sola, mientras que la expresión reducida de estos genes fibróticos mediada por La eliminación de Kdm5b podría revertirse mediante la eliminación de Atf3 (Fig. 7i, j). Estos datos indican que ATF3 es un objetivo aguas abajo de KDM5B y que la deficiencia de KDM5B atenúa la fibrosis cardíaca al aumentar la expresión de ATF3.

un mapa de calor que muestra los 20 principales genes expresados diferencialmente regulados al alza en tejidos miocárdicos de KDM5B-KO y ratones WT de control de compañeros de camada el día 7 después de la cirugía MI. b Análisis de Q-PCR de la expresión de ARNm de Atf3 y Kdm5b en los tejidos miocárdicos de ratones WT el día indicado después del IM o la operación simulada (n = 6 por grupo). #p < 0,05 frente a los niveles de ARNm de Kdm5b en el grupo de operación simulada; *p < 0,05, **p < 0,01 frente a los niveles de ARNm de Atf3 en el grupo de operación simulada. c, d Análisis Q-PCR del ARNm de Atf3 (c) (n = 6 ratones por grupo) o análisis de inmunotransferencia de los niveles de proteína ATF3 (d) en tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO o WT el día 7 después de la cirugía MI. e, f Análisis Q-PCR de la expresión del ARNm de Atf3 (e) (n = 6 por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína ATF3 (f) en fibroblastos cardíacos silenciados con Kdm5b o transfectados con siARN de control estimulados con TGF-β (10 ng /ml) durante 24 horas. g, h Análisis Q-PCR de la expresión del ARNm de Atf3 (g) (n = 6 por grupo) o análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína ATF3 (h) en fibroblastos cardíacos tratados con el inhibidor de KDM5B GSK467 o DMSO seguido de estimulación con TGF-β ( 10 ng/ml) durante 24 h. i Análisis de inmunotransferencia de la expresión de la proteína ATF3 en fibroblastos cardíacos transfectados con ARNip de Atf3 o ARNip de control. j Análisis Q-PCR de los niveles de expresión de ARNm de Col1a1, Col3a1, Fn1 y Ccn2 en fibroblastos cardíacos transfectados con ARNip de Kdm5b, ARNip de Atf3, ARNip de control o cotransfectados con ARNip de Kdm5b y Atf3 seguido de estimulación con TGF-β (10 ng/ml) para 24 h (n = 6 por grupo). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Se realizaron la prueba t de Student no pareada (c, e, g) y ANOVA (b, j).

Dado que KDM5B es una histona H3K4me3 y H3K4me2 desmetilasa15, a continuación exploramos si KDM5B regulaba la expresión de ATF3 al afectar el nivel de metilación de la histona H3K4. El reclutamiento de KDM5B para el promotor Atf3 mejoró notablemente en los fibroblastos cardíacos después de la estimulación con TGF-β (Fig. 8a). Se observaron niveles marcadamente aumentados de H3K4me2 y H3K4me3 en fibroblastos cardíacos aislados de tejidos miocárdicos de ratones KDM5B-KO (Fig. 8b). De manera constante, la eliminación de Kdm5b o el tratamiento con GSK467 elevaron los niveles de H3K4me2 y H3K4me3 en fibroblastos cardíacos de tipo salvaje estimulados con TGF-β (Fig. 8c, d). Se encontraron niveles reducidos de H3K4me2 y H3K4me3 en el promotor del gen Atf3 en fibroblastos cardíacos de tipo salvaje después de la estimulación con TGF-β durante 24 h (Fig. 8e, f). Por el contrario, la deficiencia de KDM5B aumentó notablemente los niveles de H3K4me2 y H3K4me3 en el promotor del gen Atf3 en fibroblastos cardíacos en respuesta al tratamiento con TGF-β (Fig. 8g, h). Estos resultados demuestran que KDM5B se une directamente al promotor Atf3 e inhibe la transcripción de ATF3 a través de su actividad de histona desmetilasa, lo que a su vez exacerba la fibrosis cardíaca y la remodelación cardíaca adversa después de un infarto de miocardio y sobrecarga de presión (Figura 9 complementaria).

un análisis de ChIP de los niveles de enriquecimiento de KDM5B en el promotor Atf3 en fibroblastos cardíacos WT tratados con TGF-β (10 ng/ml) o el PBS de control (Ctrl) durante 24 h. n = 6 por grupo. b–d Análisis de inmunotransferencia de los niveles de H3K4me2 y H3K4me3 en fibroblastos cardíacos con deficiencia de KDM5B (b), silenciamiento de KDM5B (c) o tratamiento con GSK467 (d) y los fibroblastos cardíacos de control correspondientes (b–d) estimulados con TGF-β (10 ng /ml) durante los tiempos indicados. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes. e, f Análisis de ChIP de los niveles de H3K4me2 (e) o H3K4me3 (f) en el promotor Atf3 de fibroblastos cardíacos WT tratados con TGF-β (10 ng/ml) o PBS de control (Ctrl) durante 24 h. n = 6 por grupo. g, h Análisis de ChIP de los niveles de H3K4me2 (g) o H3K4me3 (h) en el promotor Atf3 de fibroblastos cardíacos deficientes en KDM5B (KO) o WT estimulados con TGF-β (10 ng/ml) durante 24 h. n = 6 por grupo. *p < 0,05, ***p < 0,001. Se realizó ANOVA de dos vías (a, e-h).

La fibrosis cardíaca, que es la característica patológica más común de muchos trastornos cardíacos, se asocia con un mal pronóstico, como la insuficiencia cardíaca. En este estudio, revelamos el papel novedoso de la histona desmetilasa KDM5B para facilitar la patogénesis de la fibrosis cardíaca. KDM5B medió en la desmetilación de H3K4me2/3 activado en el promotor de Atf3 y reprimió la expresión de Atf3, lo que resultó en una fibrosis cardíaca excesiva y el deterioro de la función cardíaca después de un ataque isquémico e hipertrófico.

La expresión aberrante de múltiples genes patógenos está estrechamente relacionada con el desarrollo y la progresión de enfermedades cardíacas. Las distintas modificaciones epigenéticas y sitios de histonas juegan papeles críticos y precisos en la regulación de la transcripción de estos genes patógenos26. Entre los diferentes tipos de modificaciones de histonas, el perfil de modificación de metilación reversible mediado por histonas metiltransferasas y desmetilasas tiene funciones importantes en múltiples procesos fisiológicos y patológicos27. Un estudio anterior mostró que G9a, una metiltransferasa que media la monometilación/dimetilación de H3K9, formaba un complejo con el factor potenciador de miocitos 2C (MEF2C) y se unía a la heterocromatina para suprimir la fibrosis cardíaca28. El silenciamiento del dominio SET de histona metiltransferasa específico del endotelio que contiene 1 (SET1) podría inhibir la fibrosis y la hipertrofia cardíaca al reprimir la transcripción de endotelina-1 en respuesta al tratamiento crónico con AngII29. Sin embargo, los estudios sobre el papel de las histonas desmetilasas en la fibrosis cardíaca patológica son limitados. El factor de transcripción A relacionado con la miocardina (MRTF-A) promueve el tráfico de macrófagos al interactuar con la lisina desmetilasa 3 A (KDM3A) para empeorar la fibrosis y la hipertrofia cardíacas, pero aún no está claro si el KDM3A funciona de manera dependiente de la actividad de la desmetilasa30. Para la importante histona H3K4me2/3 desmetilasa KDM5B, los estudios previos sobre su función se han centrado en enfermedades oncológicas e infecciosas. Por ejemplo, KDM5B suprimió la inmunidad antitumoral y medió la evasión inmune en el melanoma al reclutar SETDB1 (dominio SET bifurcado histona lisina metiltransferasa 1) para silenciar los retroelementos31. La deficiencia de KDM5B promovió significativamente la producción de citocinas inflamatorias y facilitó las respuestas inflamatorias innatas provocadas por diversos patógenos17,32. Nuestro estudio proporciona evidencia de que KDM5B impulsa la progresión de la fibrosis cardíaca patológica al mediar la desmetilación de H3K4me2/3 activado en el promotor Atf3 e inhibir su expresión. Por lo tanto, nuestros hallazgos identifican a KDM5B como una nueva histona desmetilasa profibrótica y revelan un nuevo enfoque regulador epigenético para la fibrosis cardíaca en condiciones de estrés patológico.

Las principales manifestaciones de la fibrosis cardíaca son la conversión excesiva de fibroblastos en miofibroblastos acompañada de una síntesis excesiva y una degradación insuficiente de la matriz extracelular, lo que conduce a una disminución de la distensibilidad miocárdica, disfunción diastólico-sistólica e incluso la aparición de insuficiencia cardíaca2. La fibrosis cardíaca patológica depende de la regulación transcripcional de múltiples vías de señalización fibrótica, de las cuales los factores de transcripción tienen funciones reguladoras importantes en la activación de los componentes de la señal33. En este estudio, encontramos que la expresión de ATF3 aumentó notablemente en el miocardio de ratones deficientes en KDM5B en condiciones patológicas. Además, demostramos que la deficiencia de KDM5B promovió la expresión de ATF3 al elevar los niveles de metilación de H3K4me2/3 activada en su región promotora. Estos resultados confirman que el factor de transcripción ATF3 es un objetivo esencial aguas abajo de KDM5B durante la fibrosis cardíaca. Estudios anteriores han demostrado que ATF3 desempeña funciones duales en la fibrosis en diferentes órganos. La evidencia acumulada ha demostrado que ATF3 limita la progresión de la fibrosis cardíaca y previene la remodelación cardíaca adversa provocada por una lesión isquémica o hipertrófica24,25,34. Sin embargo, la sobreexpresión de ATF3 se encontró en hígados fibróticos y contribuyó a la fibrosis hepática al activar las células estrelladas hepáticas35. Además, ATF3 juega un papel profibrótico en la esclerosis sistémica y la lesión pulmonar inducida por bleomicina36,37. Las diferencias funcionales en ATF3 en la fibrosis de órganos pueden estar asociadas con diferentes tipos de células y mecanismos profibróticos. De acuerdo con informes anteriores sobre el corazón, nuestros datos confirman que ATF3, que es un regulador clave que es suprimido epigenéticamente por KDM5B, puede inhibir la fibrosis miocárdica mediada por fibroblastos cardíacos en respuesta al estrés isquémico o hipertrófico.

Debido a la capacidad de regeneración extremadamente baja de los cardiomiocitos, la reconstrucción y restauración de la red de flujo sanguíneo en el área infartada son fundamentales para la reparación después de una lesión miocárdica en enfermedades isquémicas. La angiogénesis cardíaca es crucial para mantener la función cardíaca y la adaptación miocárdica a la sobrecarga de presión23,38. Las células endoteliales se consideran las células más importantes que median la angiogénesis, pero no se debe descuidar la contribución de los fibroblastos. Los fibroblastos pueden promover la angiogénesis mediada por células endoteliales a través de la secreción paracrina y pueden transdiferenciarse en células endoteliales, mediando la angiogénesis después de una lesión cardíaca9,39,40,41. Nuestro estudio proporciona evidencia de que la deficiencia de KDM5B aumenta la expresión de genes asociados con la angiogénesis y promueve la transdiferenciación de fibroblastos a células de tipo endotelial, lo que mejora la angiogénesis y contribuye al alivio de la disfunción cardíaca en condiciones patológicas. El mecanismo subyacente de la angiogénesis mejorada mediada por la deficiencia de KDM5B puede implicar la regulación de la expresión de varios factores de transcripción, como Nodal, que debe investigarse más a fondo.

Las terapias epigenéticas han surgido como áreas de investigación novedosas y valiosas en el descubrimiento de fármacos. La disponibilidad de varios reguladores de enzimas de modificación epigenética en ensayos clínicos se ha centrado principalmente en enfermedades oncológicas. Por ejemplo, el inhibidor selectivo de la histona metiltransferasa EZH2 (potenciador de la subunidad 2 del complejo represivo zeste 2 polycomb) o la histona desmetilasa LSD1 (desmetilasa 1 específica de lisina) mostró una actividad antitumoral prometedora en tumores sólidos o leucemia42,43. Sin embargo, menos inhibidores epigenéticos han mostrado respuestas efectivas en ensayos clínicos para enfermedades distintas del cáncer, especialmente enfermedades cardiovasculares. Nuestros resultados in vitro confirmaron la eficacia del inhibidor de KDM5B para suprimir las respuestas profibróticas mediadas por fibroblastos. Junto con los datos in vivo que muestran la atenuación de la fibrosis cardíaca mediada por la deficiencia de KDM5B, nuestro estudio abre nuevos caminos para el desarrollo de una terapia epigenética dirigida a KDM5B para superar la fibrosis cardíaca patológica.

En resumen, nuestros resultados demuestran que la histona desmetilasa KDM5B suprime la expresión de ATF3 al desmetilar H3K4me2/3 en su promotor, promoviendo posteriormente una expresión excesiva de genes profibróticos e inhibiendo la angiogénesis. KDM5B impulsa la progresión de la fibrosis cardíaca y facilita la remodelación cardíaca adversa en respuesta al estrés isquémico o hipertrófico, lo que ayudará en el desarrollo de nuevas terapias epigenéticas para la fibrosis cardíaca patológica y la insuficiencia cardíaca.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFA0801502), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070415, 82071790, 82101842) y el Programa Shuguang patrocinado por la Fundación para el Desarrollo de la Educación de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái (19SG17, 18SG33).

Laboratorio clave de arritmias del Ministerio de Educación de China, Centro de Investigación de Medicina Traslacional, Hospital Este de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad de Tongji, 200120, Shanghái, China

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Yunkai Zhang, Yuyu Jiang y Xingguang Liu

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Qingqing Zhou y Zhenzhen Zhan

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Zhenzhen Zhan

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BW, YT, YZ, SZ, XD, YJ, TL y QZ realizaron los experimentos, analizaron los datos e interpretaron los resultados. BW redactó el manuscrito y realizó los análisis estadísticos. ZZ y XL concibieron la idea, diseñaron los experimentos, analizaron los datos, revisaron el manuscrito y financiaron este estudio. Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito en busca de contenido intelectual importante.

Correspondencia a Xingguang Liu o Zhenzhen Zhan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Wang, B., Tan, Y., Zhang, Y. et al. La pérdida de KDM5B mejora la fibrosis y la disfunción cardíaca patológica al mejorar epigenéticamente la expresión de ATF3. Exp Mol Med 54, 2175–2187 (2022). https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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Recibido: 19 Abril 2022

Revisado: 26 de septiembre de 2022

Aceptado: 24 de octubre de 2022

Publicado: 08 diciembre 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00904-y

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